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Am 19. März 1901 wurde das städtische Elektrizitätswerk eröffnet und am 1. April 1901 erfolgte die feierliche Inbetriebnahme der elektrischen Straßenbahn Jena. Mit der Vereinigung der thüringischen Staaten 1920 wurde Jena Teil des Landes Thüringen, die Stadt 1922 kreisfrei. Gleichzeitig entstand der Landkreis Stadtroda, zu dem das Umland gehörte. Innerhalb der Arbeiterschaft der großen Werke Zeiss und Schott fanden die Arbeiterparteien SPD und KPD starken Zulauf, so dass während der Zeit der Weimarer Republik die konservativen Parteien und die NSDAP die schlechtesten Wahlergebnisse in Thüringen erreichten. Demzufolge war auch der spätere Widerstand gegen die Nationalsozialisten stärker ausgeprägt.

Schon bei der Thüringer Landtagswahl 1924 hatten völkische Kräfte dem bürgerlich-konservativen Thüringer Ordnungsbund zur Mehrheit verholfen.^[1] Nach der Landtagswahl 1929 wurde Thüringen von der sogenannten Baum-Frick-Regierung regiert, an der die NSDAP beteiligt war.^[2] Bei der Thüringer Landtagswahl 1932 erreichte die NSDAP schließlich 42,5 % der Stimmen und wurde damit stärkste Kraft.^[3] Im gleichen Jahr wurde Fritz Sauckel Staatsminister des Inneren in Thüringen und übernahm auch den Vorsitz der Landesregierung.^[4]

Mit der Machtübertragung der Kanzlerschaft an Adolf Hitler begann in der Stadt die Diskriminierung und Verfolgung aller politischen und humanistischen Kräfte. Viele erhielten Gefängnis- und Zuchthausstrafen oder wurden als „Schutzhäftlinge“ in das erste KZ Nohra, seinen Nachfolger KZ Bad Sulza und später in das KZ Buchenwald eingeliefert. Nach dem Berufsbeamtengesetz wurden zahlreiche missliebige Wissenschaftler von ihren Posten vertrieben. Die Universität mutierte mehr und mehr zu einem Ideologie-Produzenten von Rassismus (Lehrstuhl für Sozialanthropologie) und Antisemitismus (Zusammenarbeit mit dem kirchlichen Institut zur Erforschung und Beseitigung des jüdischen Einflusses auf das deutsche kirchliche Leben).

Ab 1. April 1933 wurden jüdische Geschäfte und Einrichtungen boykottiert. Am 26. August 1933 organisierten die Hitlerjugend und die Nationalsozialistische Betriebszellenorganisation (NSBO) auf dem Marktplatz eine Bücherverbrennung.^[5][6] Sie wurde absichtlich an diesem Tag durchgeführt, anlässlich des ersten Jahrestags der Machtübernahme der NSDAP in Thüringen 1932.^[7]

Im Oktober 1938 wurden in der „Polenaktion“ zehn jüdische Personen ohne Staatsangehörigkeit nach Polen abgeschoben. Während der Novemberpogrome 1938 gab es in der Stadt antijüdische Ausschreitungen. In der Folgezeit konnten noch zahlreiche jüdische Familien und Einzelpersonen ins Ausland emigrieren. In den Jahren 1942 bis 1945 wurden die verbliebenen Juden vom Westbahnhof aus in die Gettos und Vernichtungslager des Ostens deportiert und ermordet. Das Gedenkbuch des Bundesarchivs für die Opfer der nationalsozialistischen Judenverfolgung in Deutschland (1933–1945) verzeichnet namentlich 73 jüdische Einwohner Jenas, die deportiert und größtenteils ermordet wurden.^[8] Etliche Juden, darunter Clara Rosenthal,^[9] nahmen sich selbst das Leben.

Das Gesetz zur Verhütung erbkranken Nachwuchses ermöglichte in der Chirurgischen Klinik und der Frauenklinik die Durchführung zahlreicher Zwangssterilisationen. Später wurden Patienten in Euthanasie-Anstalten ausgeliefert. In den Jenaer Rüstungsbetrieben waren Tausende Zwangsarbeiter beschäftigt. Kurz vor Ende des Krieges unternahm eine Sabotagegruppe einen Sprengstoffanschlag auf das NSDAP-Büro. Ab September 1944 mussten zudem im KZ-Außenlager „RAW Jena“, einem Außenlager des KZ Buchenwald, bis zu 1000 Häftlinge im anliegenden Reichsbahnausbesserungswerk (RAW) Zwangsarbeit leisten. Insgesamt mussten ca. 14.000 Menschen aus verschiedenen europäischen Ländern in Jena Zwangsarbeit leisten^[10], z. B. bei Carl Zeiss Jena^[11] oder an der medizinischen Fakultät der Universität für den Bau von Luftschutzbunkern oder an den Universitätskliniken.^[12]

Im Zweiten Weltkrieg richteten alliierte Bombenangriffe, besonders im Februar und März 1945, zahlreiche Zerstörungen an. Das schwerste Bombardement erfolgte am 19. März 1945. Insgesamt warfen die US Army Air Forces bei ihren Angriffen 870 Tonnen Bomben auf Jena ab.^[13] Die Bombenangriffe verursachten schwere Schäden und Totalzerstörungen, ein großer Teil des Stadtzentrums wurde vernichtet; die Ruinen der teils historischen Bürgerhäuser wurden später abgetragen. Verloren gingen das Haus am Markt, in dem Goethe und Schiller ihren Freundschaftsbund geschlossen hatten, das Griesbachsche und Bachsteinsche Haus, das Stadtmuseum und der historische Burgkeller. Die Stadtkirche St. Michael erlitt starke Beschädigungen. Die Collegien- oder Universitäts-Kirche wurde zerstört und die Ruine 1956 abgetragen. Ihr Turm wie auch die Collegien-Gebäude wurden beschädigt. Das Rathaus wurde teilzerstört, die Hof- und Rats-Apotheke sowie die Universitäts-Bibliothek wurden zerstört und später abgetragen. Das Abbeanum erlitt schwere Schäden und wurde bis 1951 wieder aufgebaut.^[14] Völlig zerstört wurden die Universitätsbibliothek und sechs Universitäts-Institute, teilzerstört mehrere Kliniken in der Bachstraße.^[15] 709 Menschen verloren ihr Leben, 2000 wurden schwer verletzt.^[16]

Am 11. April 1945 fand das letzte große Verbrechen der nationalsozialistischen Herrschaft in Jena statt: Auf einem Todesmarsch trieben SS-Männer und Polizeikräfte mehr als 4.000 Menschen aus dem Konzentrationslager Buchenwald durch Jena. Wer erschöpft war oder zu fliehen versuchte, wurde auf offener Straße erschossen. Nach Schätzungen starben dadurch mehr als 250 Personen.^[17]

Beim Beschuss der Stadt durch US-amerikanische Artillerie am 11. April 1945 starben 40 Menschen. Am 13. April 1945 besetzten US-amerikanische Truppen kampflos die Stadt. Bei Kriegsende waren große Teile der Stadt zerstört. 1424 Wohnungen und 140 Geschäfts- und Warenhäuser waren vernichtet, 4743 Wohnungen schwer beschädigt. Jena war nach Nordhausen die am meisten zerstörte Stadt in Thüringen.^[18] Trotzdem besteht der Hauptteil der Stadt heute aus Gebäuden von vor dem Zweiten Weltkrieg.^[19]

Am 1. Juli 1945 zogen Einheiten der Roten Armee in die Stadt ein, Jena wurde Teil der Sowjetischen Besatzungszone.