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Mattioli war nicht nur Verfasser fachmedizinischer Schriften, sondern ein Vertreter des volkssprachlichen Renaissance-Humanismus, der durch die Übersetzung wissenschaftlicher Werke aus dem Griechischen und Lateinischen gelehrtes Wissen in seiner Muttersprache popularisierte und dadurch zugleich deren Vokabular und wissenschaftliche Ausdrucksmöglichkeiten erweiterte.

Als Übersetzer war er an Jacopo Gastaldis Ausgabe der Geographie des Ptolemäus (1547/48) beteiligt, erfolgreich war er jedoch vor allem als Übersetzer und Kommentator der Materia medica des Dioscurides. Im Jahr 1544 veröffentlichte er seine italienische Übersetzung der Materia medica auf der Grundlage der lateinischen Übersetzung von Jean Ruel (1516), mit einem umfangreichen eigenen, ebenfalls italienischsprachigen Kommentar, in dieser ersten Ausgabe noch ohne Abbildungen. 1548 erschien eine zweite, um ein sechstes Buch über die Antidote erweiterte Ausgabe, 1550 und 1551 eine dritte, nochmals erweiterte Ausgabe. 1554 veröffentlichte Mattioli dann unter dem Titel Commentarii in libros sex Pedacii Dioscoridis Anazarbei eine vollständig überarbeitete lateinische Fassung seines Kommentars, zusammen mit einem lateinischen Text, der nur geringfügig von Jean Ruels Text abwich. Ausgestattet war diese Ausgabe erstmals auch mit 563 Holzschnitten, die dann ab der vierten italienischen Ausgabe von 1555 auch in deren Neuauflagen übernommen wurden.

Dank der finanziellen Unterstützung der Habsburger erschienen zwei Prachtausgaben in der Prager Offizin von Georg Melantrich von Aventin, die eine von Thaddäus Hajek aus dem Lateinischen übertragen ins Alttschechische (1562)^[1], die andere aus dem Lateinischen ins Deutsche übersetzt von Georg Handsch (Neuw Kreütterbuch, 1563). Aufgrund der großen Nachfrage gab Joachim Camerarius der Jüngere später die Hand'sche Übertragung noch einmal in einer neuen Bearbeitung heraus (Kreutterbuch. Frankfurt am Main 1586), teilweise ergänzt durch Abbildungen aus dem Nachlass Conrad Gessners.

Mattioli beschrieb eine Reihe von Arten, die in den Kräuterbüchern der Väter der Botanik nicht enthalten sind. So beschrieb er als einer der ersten im Jahre 1544 die aus Amerika eingeführte Tomate und bezeichnete die gelben Formen als „mala aurea“, „goldene Äpfel“. Auch die erste Abbildung der Rosskastanie in einem europäischen Kräuterbuch stammt von ihm. Über diesen Baum hatte ihm Willem Quackelbeen (1527–1561) in einem Brief aus Istanbul berichtet, wo dieser Arzt des Botschafters Ogier Ghiselin de Busbecq von Kaiser Ferdinand I. am Hof Sultan Süleymans I. war. Mattiolis Werk war erfolgreich. Giuseppe Moretti (1782–1853) besaß 40 verschiedene Ausgaben und konnte 21 weitere in Bibliotheken konsultieren. Allein in der Zeit bis 1563 sollen laut Peter Handsch vber die zwy vnnd dreyssig tausendt Exemplar verkauft worden sein.