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Dee wurde 1527 als Sohn des wohlhabenden und aus altem Adel stammenden Rowland Dee im Tower Ward (City of London) geboren. Der walisische Familienname Dee soll von walisisch du (‚schwarz‘) abgeleitet worden sein. Dee besuchte die Chelmsford Chantry School und ab 1542 das St John’s College in Cambridge. 1545 erhielt er den Bachelor of Arts. Im Mai 1547 reiste er in die Niederlande, um bei dem Mathematiker und Astronomen Gemma Frisius und dessen Schüler, dem Kartografen Gerhard Mercator, zu studieren. Ausgestattet mit Mercators astronomischen Instrumenten, die er für das Trinity College erwarb, kehrte Dee wenige Monate später nach Cambridge zurück. Der Erwerb solcher Geräte und Karten war von großer Bedeutung für Englands Rolle als aufstrebende Kolonialmacht in Konkurrenz zu Portugal und Spanien.

1548 wurde Dee zum Master of Arts ernannt. Er verließ Cambridge erneut, hielt sich in Frankreich und in Löwen auf. Er studierte in dieser Zeit auch unter anderem Alchemie und die Magia naturalis und erwarb sich einen ausgezeichneten wissenschaftlichen Ruf, der ihm Zugang zu höchsten Kreisen verschaffte. So pflegte er Kontakte zum Herzog von Mantua, zu Johann Capito, dem Leibarzt des dänischen Königs, zu Luis de la Cerda, dem späteren Herzog von Medinaceli, zu Sir William Pickering (1516/17–1575, von 1550 bis 1553 Botschafter in Frankreich) und dem Hofmathematiker Mathias Hacus. 1550 reiste Dee nach Paris, wo er Kontakte zu Adrien Turnèbe, Petrus Ramus, Amarus Ranconet, Jean François Fernel und Pedro Nunes unterhielt.^[1] 1552 traf er Gerolamo Cardano in London. Während ihrer Bekanntschaft arbeiteten sie an einem Perpetuum mobile und untersuchten einen Edelstein, dem magische Eigenschaften nachgesagt wurden. Dee hielt Vorlesungen in Paris über Euklid. Seine Reisen führten Dee auch ins Heilige Römische Reich. So brachte er 1564 dem in Duisburg lebenden Kartografen Gerhard Mercator eine Karte mit, die dieser für seine Wandkarte der Britischen Inseln benötigte.

1554 wurde Dee in Oxford ein Lehrstuhl für Mathematik angeboten, den er ablehnte, da in seinen Augen die englischen Universitäten zu sehr auf Rhetorik und Grammatik ausgerichtet seien – diese beiden Fächer bildeten zusammen mit Logik das akademische Trivium –, während die Fächer Philosophie und Wissenschaft, also das weiter fortgeschrittene Quadrivium, das Arithmetik, Geometrie, Musik und Astronomie beinhaltete, vernachlässigt würden. Dee präsentierte Königin Maria I. einen visionären Plan für die Erhaltung alter Bücher, Manuskripte und Aufzeichnungen und schlug 1556 die Gründung einer Nationalbibliothek vor, doch sein Plan fand keine Unterstützung. Stattdessen baute er in seinem Haus in Mortlake eine private Bibliothek auf, indem er ständig Bücher aus England und dem europäischen Kontinent zukaufte. So wurde seine Bibliothek mit rund 4000 Bänden zur größten Sammlung Englands seiner Zeit und zog viele Gelehrte an. 1555 wurde Dee, wie bereits sein Vater, durch das System der Vererbung (Patrimonium) der Zunft Mitglied der Worshipful Company of Mercers (‚Ehrenwerte Zunft der Händler‘).

Im selben Jahr, 1555, wurde er unter der Herrschaft von Maria I. verhaftet und wegen der Ausübung von schwarzer Magie und Zauberei gegen die Königin angeklagt.^[2] Der Anklage wurde später der Vorwurf des Verrats an Maria hinzugefügt. Dee erschien vor der Star Chamber und verteidigte sich selbst, wurde aber dem katholischen Bischof Bonner zur religiösen Begutachtung zugewiesen. Dee wurde nach kurzer Haft freigelassen.^[3] Später wurde Dee zu einem engen Freund Bonners.

Als Elisabeth I. 1558 den Thron bestieg, ernannte sie ihn zu ihrem engsten Berater in Sachen Astrologie und Wissenschaft. Er erhielt jedoch nie eine Anstellung, die ihm finanzielle Unabhängigkeit sicherte.^[3] Er sei auch mit der Wahl von Elisabeths Krönungsdatum betraut gewesen. In den 1550er bis 1570er Jahren diente er als Berater bei Englands Entdeckungsreisen, bot technische Hilfe bei der Navigation und ideologische Unterstützung bei der Gründung des „Britischen Empires“. 1577 veröffentlichte Dee General and Rare Memorials pertayning to the Perfect Arte of Navigation, eine Arbeit, die seine Vision eines maritimen Weltreichs und angeblicher englischer Territorialansprüche an die Neue Welt darlegt.

Dee war mit Humphrey Gilbert bekannt und stand Sir Philip Sidney sowie dessen Kreis nahe. Ein Freund und Schüler war der frühe englische Kopernikaner Thomas Digges. Es ist außerdem bekannt, dass Königin Elisabeth I. sein Haus in Mortlake mehrfach besuchte, so 1574, wobei er ihr seinen magischen Kristall zeigte. 1577 trug er ihr in Windsor seine Ansicht zu dem neu aufgetretenen Kometen vor und 1578 beriet er sie in Fragen ihrer Gesundheit und soll auch deshalb nach Deutschland gereist sein.^[4] 1580 besuchte ihn die Königin erneut.

1564 veröffentlichte Dee die hermetische Arbeit Monas Hieroglyphica (‚Die hieroglyphische Monade‘), die erschöpfende kabbalistische Interpretation einer Glyphe einzigartigen Aufbaus, mit der die mystische Einheit der gesamten Schöpfung zum Ausdruck gebracht werden sollte. Diese Arbeit wurde von vielen Zeitgenossen Dees hoch geschätzt. In Vorbereitung ihres Drucks soll er auch in Antwerpen gewesen sein.^[5]

Er veröffentlichte 1570 ein Mathematical Preface (‚Mathematische Einleitung‘) zu Henry Billingsleys englischer Übersetzung von Euklids Elementen, worin er die zentrale Bedeutung der Mathematik sowie deren Einfluss auf die anderen Künste und Wissenschaften hervorhob. Obwohl eigentlich für den ungebildeten Leser gedacht, erwies es sich als Dees einflussreichstes Werk und wurde häufig nachgedruckt.